{"id":2328,"date":"2015-11-23T00:00:00","date_gmt":"2015-11-23T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/lab.fabricadelandings.com.br\/portalsaofrancisco\/uncategorized\/eletroforese\/"},"modified":"2015-11-23T00:00:00","modified_gmt":"2015-11-23T00:00:00","slug":"eletroforese","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/lab.fabricadelandings.com.br\/portalsaofrancisco\/biologia-2\/eletroforese\/","title":{"rendered":"Eletroforese"},"content":{"rendered":"\n

Eletroforese – O que \u00e9<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Eletroforese\u00a0<\/strong>\u00e9 definida como migra\u00e7\u00e3o de part\u00edculas sob influ\u00eancia de um campo el\u00e9trico.<\/p>\n\n\n\n

O princ\u00edpio f\u00edsico da eletroforese \u00e9 bastante simples:<\/strong>\u00a0part\u00edculas com carga el\u00e9trica s\u00e3o aceleradas quando colocadas em um campo el\u00e9trico; essa for\u00e7a de propuls\u00e3o \u00e9 rapidamente balanceada pela for\u00e7a de fric\u00e7\u00e3o do meio, nesse momento as part\u00edculas movem-se \u00e0 uma velocidade constante, proporcional \u00e0 corrente el\u00e9trica.<\/p>\n\n\n\n

Quando uma mol\u00e9cula se move em um campo el\u00e9trico, a taxa de migra\u00e7\u00e3o e a dire\u00e7\u00e3o da migra\u00e7\u00e3o dependem do n\u00famero de cargas e do sinal da carga (+ ou -).<\/p>\n\n\n\n

Se a mol\u00e9cula tem carga positiva, ela vai se mover para o polo negativo e vice-versa.<\/p>\n\n\n\n

Em g\u00e9is como o de poliacrilamida, o meio funciona como uma peneira, retardando preferencialmente as mol\u00e9culas grandes, fazendo com que sejam separadas pelo seu tamanho.<\/p>\n\n\n\n

Em gen\u00e9tica, a\u00a0eletroforese<\/strong>\u00a0\u00e9 utilizada para detectar a variabilidade em enzimas, prote\u00ednas, DNA e RNA.<\/p>\n\n\n\n

Eletroforese – Prote\u00edna<\/strong><\/p>\n\n\n\n

O termo\u00a0prote\u00edna<\/strong>\u201d foi criado por Mulder, em 1839, referindo-se \u00e0s subst\u00e2ncias qu\u00edmicas que integravam a mat\u00e9ria viva, tanto animal como vegetal.<\/p>\n\n\n\n

O nome se originou do grego proteios\u201d, que significa prim\u00e1rio\u201d, essencial\u201d, em fun\u00e7\u00e3o da sua signific\u00e2ncia biol\u00f3gica, j\u00e1 na \u00c9poca apontada pelo autor. Alguns anos mais tarde, em 1851, utilizando uma t\u00e9cnica de precipita\u00e7\u00e3o com \u00c1cido ac\u00e9tico, Panum conseguiu separar uma fra\u00e7\u00e3o das prote\u00ednas, que designou case\u00edna do sor, sendo, posteriormente, em 1862, chamada de globulina ou subst\u00e2ncia fibropl\u00e1stica, por Schimidt.<\/p>\n\n\n\n

Em 1866, Kuhne foi o primeiro a citar as fra\u00e7oes prot\u00e9icas, obtendo duas partes, uma atrav\u00e9s da precipita\u00e7\u00e3o com anidro carb\u00f4nico, que denominou de paraglobulina, e outra com \u00c1cido ac\u00e9tico, que denominou de alca-lialbuminato, tendo sido posteriormente denominada de seroglobulina, por Weil e Hynius.<\/p>\n\n\n\n

A comprova\u00e7\u00e3o de que as part\u00edculas coloidais, no caso concreto as prote\u00ednas, podem ser separadas atrav\u00e9s das suas caracter\u00edsticas de mobilidade frente a campos el\u00e9tricos, constituindo o fundamento da eletroforese, teve in\u00edcio com os estudos de Michaelis, em 1909, que idealizou o tubo em U. A t\u00e9cnica foi aperfei\u00e7oada por Sverdberg e Scott (1924), Sverdberg e Tiselius (1926) e Theorell (1935).<\/p>\n\n\n\n

O desenvolvimento de metodologias para a medi\u00e7\u00e3o dos componentes prot\u00e9icos no sangue teve in\u00edcio no final do s\u00e9culo XIX, com a publica\u00e7\u00e3o, em 1878, do Trait\u00e9 pratique et elementaire de chimie m\u00e9dicale (Tratado pr\u00e1tico e elementar de qu\u00edmica m\u00e9dica), por Mehu, um qu\u00edmico franc\u00eas do Hospital Necker de Paris, que propunha um m\u00e9todo para a quantifica\u00e7\u00e3o do que designou de albumina ou albumin\u00f3ides.<\/p>\n\n\n\n

O m\u00e9todo que veio a se tornar a base para o sistema atual de eletroforese para a separa\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas foi desenvolvido no in\u00edcio dos anos 1930 por Arn Tiselius, ganhador do pr\u00eamio Nobel.<\/p>\n\n\n\n

Eletroforese – Conceito<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Eletroforese<\/strong>\u00a0\u00e9 um termo bastante amplo, que se refere \u00e0 migra\u00e7\u00e3o de solutos e part\u00edculas em um meio l\u00edquido, sob influ\u00eancia de um campo magn\u00e9tico. As prote\u00ednas possuem cargas positivas e negativas, sendo sua mobilidade eletrofor\u00e9tica diretamente proporcional \u00e0 carga da part\u00edcula e inversamente proporcional \u00e0 viscosidade do meio.<\/p>\n\n\n\n

Eletroforese<\/strong>\u00a0\u00e9 uma t\u00e9cnica de laborat\u00f3rio usada para separar mol\u00e9culas de DNA, RNA ou prote\u00ednas com base em seu tamanho e carga el\u00e9trica.<\/p>\n\n\n\n

Uma corrente el\u00e9trica \u00e9 usada para mover as mol\u00e9culas a serem separadas por meio de um gel. Os poros no gel funcionam como uma peneira, permitindo que as mol\u00e9culas menores se movam mais r\u00e1pido do que as mol\u00e9culas maiores.<\/p>\n\n\n\n

As condi\u00e7\u00f5es usadas durante a eletroforese podem ser ajustadas para separar mol\u00e9culas em um intervalo de tamanho desejado.<\/p>\n\n\n\n

Eletroforese – T\u00e9cnica<\/strong><\/p>\n\n\n\n

A\u00a0eletroforese<\/strong>\u00a0\u00e9 uma t\u00e9cnica baseada na separa\u00e7\u00e3o de part\u00edculas, que ocorre quando as mesmas s\u00e3o dissolvidas ou suspensas em um eletr\u00f3lito, atrav\u00e9s do qual uma corrente el\u00e9trica \u00e9 aplicada.<\/p>\n\n\n\n

\u00c9 tamb\u00e9m usada na identifica\u00e7\u00e3o de subst\u00e2ncias, no estudo de homogeneidade de sistemas biol\u00f3gicos e na determina\u00e7\u00e3o de pontos isoel\u00e9tricos.<\/p>\n\n\n\n

Esta t\u00e9cnica consiste na migra\u00e7\u00e3o de mol\u00e9culas ionizadas, em solu\u00e7\u00e3o, de acordo com suas cargas el\u00e9tricas e pesos moleculares em campo el\u00e9trico. Mol\u00e9culas com carga negativa migram para o p\u00f3lo positivo (\u00e2nodo) e mol\u00e9culas com carga positiva migram para o p\u00f3lo negativo (c\u00e1todo).<\/p>\n\n\n\n

Arne Tiselus desenvolveu a eletroforese livre, para o estudo de prote\u00ednas em soro (atrav\u00e9s do qual ganhou o Premio Nobel em 1948), um tipo de eletroforese em que as subst\u00e2ncias a serem separadas est\u00e3o em solu\u00e7\u00e3o ou suspens\u00e3o, e que n\u00e3o emprega suporte.<\/p>\n\n\n\n

Este m\u00e9todo de solu\u00e7\u00e3o livre era bastante limitado devido a essas solu\u00e7\u00f5es estarem sujeitas a uma s\u00e9rie de influ\u00eancias f\u00edsicas do ambiente que lhes causam perturba\u00e7\u00f5es, tais como ondas mec\u00e2nicas e at\u00e9 mesmo movimentos de convec\u00e7\u00e3o do l\u00edquido pelo aquecimento da solu\u00e7\u00e3o causado pela aplica\u00e7\u00e3o da diferen\u00e7a de potencial. Estas perturba\u00e7\u00f5es fazem com que a eletroforese, nessas condi\u00e7\u00f5es, seja um processo muito pouco reprodut\u00edvel, com as cargas de mesma natureza n\u00e3o migrando juntas, mas sim, dispersas.<\/p>\n\n\n\n

Para contornar esses problemas, desenvolveram-se sistemas em que tais perturba\u00e7\u00f5es \u00e0 eletroforese s\u00e3o minimizadas. Esses sistemas utilizam matrizes r\u00edgidas \u2013 conhecidas como suportes \u2013 com as quais a solu\u00e7\u00e3o interage e que diminuem as perturba\u00e7\u00f5es mec\u00e2nicas e os movimentos de convec\u00e7\u00e3o no l\u00edquido. Existem diferentes meios-suporte, tais como papel de filtro, s\u00edlica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros.<\/p>\n\n\n\n

A\u00a0eletroforese<\/strong>\u00a0que utiliza suporte \u00e9 tamb\u00e9m conhecida como eletroforese de zona, e foi iniciada por K\u00f6nig em 1937 (mesmo per\u00edodo em que a eletroforese livre era descrita por Tiselius) na separa\u00e7\u00e3o de veneno de cobra recorrendo a papel de filtro como meio-suporte, mas s\u00f3 mais tarde, em 1946, foi retomada por Martin e colaboradores.<\/p>\n\n\n\n

Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das macromol\u00e9culas, podemos separ\u00e1-las mais com base na carga ou mais com base em seu tamanho.<\/p>\n\n\n\n

Os suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as mol\u00e9culas com base no tamanho molar (sendo praticamente o \u00fanico tipo de suporte para eletroforese utilizado para a separa\u00e7\u00e3o de fragmentos de \u00e1cidos nucl\u00e9icos).<\/p>\n\n\n\n

J\u00e1 a eletroforese em suporte de papel \u00e9 muito eficiente no que diz respeito a separa\u00e7\u00e3o de part\u00edculas com grande diferen\u00e7as de cargas, como por exemplo a separa\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas que, devido \u00e0 variada composi\u00e7\u00e3o de seus amino\u00e1cidos, apresentam grandes diferen\u00e7as na carga total.<\/p>\n\n\n\n

Em raz\u00e3o de algumas part\u00edculas serem subst\u00e2ncias anf\u00f3teras, ou seja, capazes de adquirirem carga positiva ou negativa em fun\u00e7\u00e3o do pH, \u00e9 indispens\u00e1vel manter constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo uso de solu\u00e7\u00f5es-tamp\u00e3o.<\/p>\n\n\n\n

Os principais tipos de eletroforese s\u00e3o:<\/strong>

Eletroforese em gel
Eletroforese capilar<\/blockquote>
1. ELETROFORESE EM GEL<\/strong><\/p>\n\n\n\n

\u00c9 uma t\u00e9cnica de separa\u00e7\u00e3o de mol\u00e9culas onde as part\u00edculas que s\u00e3o carregadas negativamente por um composto denominado SDS (detergente dodecil sulfato de s\u00f3dio), com exce\u00e7\u00e3o do DNA que j\u00e1 possui um car\u00e1ter de c\u00e1tion, migram em um determinado gel durante a aplica\u00e7\u00e3o de uma diferen\u00e7a de potencial em dire\u00e7\u00e3o a um eletrodo positivo, sendo que este \u00e9 criado por uma corrente el\u00e9trica, e posteriormente s\u00e3o aplicadas sobre o gel.<\/p>\n\n\n\n

Para a separa\u00e7\u00e3o das mol\u00e9culas nesta t\u00e9cnica, temos que levar em considera\u00e7\u00e3o o tamanho da mol\u00e9cula, sendo que as de menor massa migram mais rapidamente do que as de maior, pois possuem mais agilidade de mobilidade. Em alguns casos o formato da mol\u00e9cula tamb\u00e9m influencia, pois dependendo do formato as mesmas ter\u00e3o mais facilidade de migrar pelo gel.<\/p>\n\n\n\n

\u00c9 importante ressaltar que a eletroforese \u00e9 utilizada normalmente para a separa\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas e mol\u00e9culas de DNA e RNA.<\/p>\n\n\n\n

1.1 SUBDIVIS\u00d5ES DA ELETROFORESE EM GEL:<\/strong><\/p>\n\n\n\n

1.1.1 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE<\/strong><\/p>\n\n\n\n

A agarose \u00e9 um polissacar\u00eddeo composto por agar e pectina.<\/p>\n\n\n\n

Para preparar este gel, simplesmente faz-se a mistura entre o p\u00f3 de agarose e solu\u00e7\u00e3o tamp\u00e3o. Ap\u00f3s fundir, coloca-se brometo de etidium, que tem ampla afinidade pelo DNA, e revela sobre presen\u00e7a de UV(ultra violeta) os \u00c1cidos nucl\u00e9icos.<\/p>\n\n\n\n

Quando a mistura esfriar o gel estar\u00e1 duro. Esse endurecimento \u00e9 feito em um local apropriado, o mesmo local onde ser\u00e1 feita a corrida da amostra.<\/p>\n\n\n\n

Um detalhe importante \u00e9 a coloca\u00e7\u00e3o do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria po\u00e7os que ser\u00e3o utilizados para a coloca\u00e7\u00e3o das amostras. Podemos ver este processo como uma corrida.<\/p>\n\n\n\n

Cada um \u00e9 colocado numa pista e na presen\u00e7a de uma corrente el\u00e9trica vai deixando o seu rasto. S\u00e3o estes rastos que ser\u00e3o comparados no m\u00e9todo.<\/p>\n\n\n\n

O gel de agarose e usado pois tem uma maior extens\u00e3o de separa\u00e7\u00e3o para fragmentos longos de DNA (identifica os \u00e1cidos nucl\u00e9icos presente neste). O tamanho e a conforma\u00e7\u00e3o da mol\u00e9cula de DNA, a concentra\u00e7\u00e3o do gel de agarose, a corrente el\u00e9trica aplicada e tipo de tamp\u00e3o usado influenciam a velocidade da part\u00edcula no gel.<\/p>\n\n\n\n

1.1.2 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA<\/strong><\/p>\n\n\n\n

A poliacrilamida \u00e9 uma mistura de dois pol\u00edmeros, acrilamida e bisacrilamida. Para preparar este gel, basta adicionar os dois pol\u00edmeros nas concentra\u00e7\u00f5es desejadas em um suporte de vidro e na presen\u00e7a de um catalisador.<\/p>\n\n\n\n

Esta t\u00e9cnica \u00e9 utilizada, pois o gel poliacrilamida tem a capacidade de separar fragmentos muito pequenos de DNA e que apresentam uma m\u00ednima diferen\u00e7a de massa, al\u00e9m disso o gel pode recuperar e purificar determinada amostra.<\/p>\n\n\n\n

Apesar das vantagens, o gel de agarose \u00e9 mais utilizado pois a poliacrilamida \u00e9 muito t\u00f3xica e dif\u00edcil de ser preparada. Neste tipo de gel a corrida \u00e9 feita em cubas verticais, e o carante utilizado \u00e9 o mesmo da eletroforese em gel de agarose.<\/p>\n\n\n\n

Existem dois tipos de gel de poliacrilamida:<\/strong>

Desnaturante:\u00a0<\/strong>separa e purifica fitas simples de DNA, e convenciona desnaturante pois e polimerizado pela ur\u00e9ia.
N\u00e3o desnaturante:<\/strong>\u00a0separa e purifica fitas duplas de DNA.<\/blockquote>
2. ELETROFORESE CAPILAR<\/strong><\/p>\n\n\n\n

A\u00a0eletroforese\u00a0<\/strong>\u00e9 definida como o transporte, em solu\u00e7\u00e3o eletrol\u00edtica, de compostos carregados eletricamente sob a influ\u00eancia de um campo el\u00e9trico, no qual a separa\u00e7\u00e3o entre dois solutos ocorre de acordo com diferen\u00e7as entre suas mobilidades eletrofor\u00e9ticas.<\/p>\n\n\n\n

Esta t\u00e9cnica que foi introduzida em 1981, por Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita cada vez mais, como um importante m\u00e9todo anal\u00edtico.<\/p>\n\n\n\n

Em sua forma mais simples a eletroforese capilar \u00e9 uma aproxima\u00e7\u00e3o da t\u00e9cnica original, descrita por Tiselius para o estudo de prote\u00ednas em soro, por\u00e9m emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletr\u00f3lito, tendo como principal vantagem o uso de capilares com di\u00e2metros internos extremamente pequenos (na faixa de 15-100 \u00b5m) permite uma melhor dissipa\u00e7\u00e3o do calor e, assim, \u00e9 poss\u00edvel obter uma alta efici\u00eancia de separa\u00e7\u00e3o com tempo reduzido de an\u00e1lise.<\/p>\n\n\n\n

A eletroforese capilar \u00e9 uma t\u00e9cnica aplic\u00e1vel na determina\u00e7\u00e3o de uma grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos arom\u00e1ticos, vitaminas hidrossol\u00faveis e lipossol\u00faveis, amino \u00e1cidos, \u00edons inorg\u00e2nicos, \u00e1cidos org\u00e2nicos, f\u00e1rmacos, catecolaminas, subst\u00e2ncias quirais, prote\u00ednas, pept\u00eddeos e muitos outros.<\/p>\n\n\n\n

Uma caracter\u00edstica que difere a eletroforese capilar das demais t\u00e9cnicas \u00e9 a sua capacidade \u00fanica para separar macromol\u00e9culas carregadas eletricamente de interesse tanto em ind\u00fastrias de biotecnologia quanto em pesquisas biol\u00f3gicas.<\/p>\n\n\n\n

Um exemplo disso \u00e9 o projeto Genoma Humano, que foi conclu\u00eddo recentemente, que teve como meta obter a seq\u00fc\u00eancia completa do DNA humano e para isso foi necess\u00e1rio distinguir os diversos polinucleot\u00eddeos, com massas molares, por volta de 200 a 500 Daltons que diferiam entre si por um \u00fanico nucleot\u00eddeo. Somente a eletroforese capilar tem resolu\u00e7\u00e3o suficiente para este tipo de separa\u00e7\u00e3o.<\/p>\n\n\n\n

Al\u00e9m disso, o DNA humano cont\u00e9m cerca de tr\u00eas bilh\u00f5es de nucleot\u00eddeos e as altas velocidades de an\u00e1lises, obtido pela eletroforese capilar, permitiram que milhares de nucleot\u00eddeos fossem seq\u00fcenciados em um \u00fanico dia.<\/p>\n\n\n\n

2.1 ELETROFORESE CAPILAR EM ZONA OU SOLU\u00c7\u00c3O LIVRE<\/strong><\/p>\n\n\n\n

A separa\u00e7\u00e3o de \u00edons \u00e9 a forma mais simples de eletroforese capilar e \u00e9 denominada eletroforese capilar em solu\u00e7\u00e3o livre ou em zona. Muitos compostos podem ser separados rapidamente e facilmente por esta t\u00e9cnica, pois a separa\u00e7\u00e3o em nesta t\u00e9cnica \u00e9 baseada nas diferen\u00e7as nas mobilidades eletrofor\u00e9ticas resultantes das diferentes velocidades de migra\u00e7\u00f5es de esp\u00e9cies i\u00f4nicas no tamp\u00e3o, contido dentro do capilar.<\/p>\n\n\n\n

Como Funciona est\u00e1 t\u00e9cnica:<\/strong><\/p>\n\n\n\n

O capilar \u00e9 preenchido com uma solu\u00e7\u00e3o tamp\u00e3o de composi\u00e7\u00e3o constante, a qual est\u00e1 presente tanto no \u00e2nodo como no c\u00e1todo.<\/p>\n\n\n\n

Em uma amostra tem-se uma mistura de esp\u00e9cies carregadas eletricamente e esp\u00e9cies neutras, onde os \u00edons, apresentam tamanhos e cargas diferentes. A amostra \u00e9 introduzida na extremidade an\u00f3dica (\u00e2nodo) do tubo e, ao ser aplicada uma diferen\u00e7a de potencial entre as extremidades da coluna, os \u00edons migram atrav\u00e9s do tubo com diferentes velocidades e em diferentes sentidos.<\/p>\n\n\n\n

A velocidade e o sentido de migra\u00e7\u00e3o dependem do tamanho e da magnitude de carga de cada \u00edon. Deve ser ressaltado que as esp\u00e9cies neutras n\u00e3o sofrem influ\u00eancia do campo el\u00e9trico e por isso migram conjuntamente.<\/p>\n\n\n\n

Na eletroforese capilar de zona, al\u00e9m dos solutos, a solu\u00e7\u00e3o tamp\u00e3o, normalmente, move-se atrav\u00e9s do capilar sob o efeito de um campo el\u00e9trico (Este fen\u00f4meno \u00e9 denominado fluxo eletroosm\u00f3tico ou eletro-endosm\u00f3tico).<\/p>\n\n\n\n

Durante uma opera\u00e7\u00e3o convencional, o fluxo eletroosm\u00f3tico origina-se no \u00e2nodo e dirige-se ao c\u00e1todo devido \u00e0 forma\u00e7\u00e3o de uma dupla camada i\u00f4nica que ocorre na interface entre o capilar de s\u00edlica fundida e a solu\u00e7\u00e3o nele contida.<\/p>\n\n\n\n

Os grupos silan\u00f3is presentes na superf\u00edcie do capilar s\u00e3o \u00e1cidos fracos que se ionizam a partir de pH 3-4 (estando totalmente ionizados em meio alcalino), criando uma superf\u00edcie carregada negativamente.<\/p>\n\n\n\n

Esta camada negativa na superf\u00edcie atrai para sua proximidade as esp\u00e9cies carregadas positivamente da solu\u00e7\u00e3o, formando uma camada positiva, a qual ser\u00e1 mobilizada pela presen\u00e7a do campo el\u00e9trico.<\/p>\n\n\n\n

A atra\u00e7\u00e3o dessa camada pelo c\u00e1todo arrasta a solu\u00e7\u00e3o do interior da coluna, criando assim um fluxo com perfil reto, em contraste com o perfil parab\u00f3lico que \u00e9 criado em sistemas pressurizados.<\/p>\n\n\n\n

O fluxo eletroosm\u00f3tico proporciona duas grandes vantagens, sendo que a primeira delas \u00e9 que c\u00e1tions e \u00e2nions podem ser separados numa \u00fanica an\u00e1lise, e a outra vantagem \u00e9 que mesmo os \u00edons com raz\u00f5es carga\/raio muito diferentes podem ser analisados em um tempo relativamente curto devido \u00e0 magnitude este fluxo.<\/p>\n\n\n\n

O pH da solu\u00e7\u00e3o tamp\u00e3o \u00e9 um dos par\u00e2metros que afeta fortemente a separa\u00e7\u00e3o em eletroforese capilar em zona, pois este par\u00e2metro afeta tanto o fluxo eletroosm\u00f3tico, quanto a mobilidade eletrofor\u00e9tica dos analitos. Isto, tendo em vista \u00e0 medida que o pH \u00e9 elevado tem-se um aumento do fluxo eletroosm\u00f3tico, pois ocorre um aumento da dissocia\u00e7\u00e3o dos grupos Si-OH que se encontram nas paredes internas do capilar.<\/p>\n\n\n\n

O fluxo eletroosm\u00f3tico \u00e9 tamb\u00e9m afetado pela concentra\u00e7\u00e3o do tamp\u00e3o e pela for\u00e7a i\u00f4nica mas, sobretudo, pelo pH. No que se refere ao controle da seletividade da separa\u00e7\u00e3o dos analitos, a varia\u00e7\u00e3o do pH afeta o grau de ioniza\u00e7\u00e3o dos analitos e, portanto, suas mobilidades eletrofor\u00e9ticas.<\/p>\n\n\n\n

Normalmente, o tamp\u00e3o \u00e9 escolhido para promover a melhor separa\u00e7\u00e3o entre os analitos e n\u00e3o necessariamente a velocidade eletroosm\u00f3tica mais adequada.<\/p>\n\n\n\n

A an\u00e1lise qualitativa \u00e9 feita atrav\u00e9s da compara\u00e7\u00e3o dos tempos de migra\u00e7\u00e3o dos padr\u00f5es com os tempos de migra\u00e7\u00e3o das subst\u00e2ncias presentes na amostra e\/ou atrav\u00e9s de espectros de UV\/Vis (detector por arranjo de diodos) ou do espectro de massas (detector espectr\u00f4metro de massas).<\/p>\n\n\n\n

A quantifica\u00e7\u00e3o das subst\u00e2ncias, com concentra\u00e7\u00f5es desconhecidas, presentes na amostra, \u00e9 feita atrav\u00e9s do procedimento usual de calibra\u00e7\u00e3o:<\/strong>

1.<\/strong>\u00a0Inje\u00e7\u00e3o de solu\u00e7\u00f5es dos padr\u00f5es de concentra\u00e7\u00f5es conhecidas
2.\u00a0<\/strong>Obten\u00e7\u00e3o das respostas do detector para cada composto, em fun\u00e7\u00e3o da altura, \u00e1rea ou \u00e1rea dividida pelo tempo de migra\u00e7\u00e3o
3.<\/strong>\u00a0Constru\u00e7\u00e3o da curva anal\u00edtica (resposta do detector versus concentra\u00e7\u00e3o)
4.<\/strong>\u00a0Inje\u00e7\u00e3o das amostras
5.<\/strong>\u00a0Obten\u00e7\u00e3o das respostas do detector para as amostras
6.\u00a0<\/strong>Quantifica\u00e7\u00e3o das subst\u00e2ncias atrav\u00e9s das curvas anal\u00edticas.<\/blockquote>
2.2 ELETROFORESE CAPILAR EM GEL<\/strong><\/p>\n\n\n\n

A separa\u00e7\u00e3o de biomol\u00e9culas grandes, tais como DNA, por ECSL, \u00e0s vezes \u00e9 muito dif\u00edcil de se obter devido \u00e0 similaridade nas raz\u00f5es massa\/carga.<\/p>\n\n\n\n

Assim ECSL muitas vezes n\u00e3o \u00e9 suficiente para separar estes tipos de subst\u00e2ncias. Uma alternativa \u00e9 preencher o capilar com um gel, onde o principal mecanismo de separa\u00e7\u00e3o est\u00e1 baseado nas diferen\u00e7as nos tamanhos dos solutos que migram atrav\u00e9s dos poros do pol\u00edmero. Esta t\u00e9cnica \u00e9 denominada eletroforese capilar em gel.<\/p>\n\n\n\n

\u00cdons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores ficam mais tempo retidos. Al\u00e9m disso, o gel serve como um meio anticonvectivo, minimizando a difus\u00e3o dos solutos.<\/p>\n\n\n\n

Ele tamb\u00e9m previne a adsor\u00e7\u00e3o do soluto nas paredes do capilar e ajuda a eliminar a eletroosmose.<\/p>\n\n\n\n

A implementa\u00e7\u00e3o da tecnologia para fabrica\u00e7\u00e3o de capilares preenchidos com gel confrontou-se com v\u00e1rios problemas. Primeiramente, ocorria o fen\u00f4meno de encolhimento do pol\u00edmero durante o processo de fabrica\u00e7\u00e3o no interior do capilar, o que gerava rupturas na estrutura final do gel. Estas rupturas estruturais formavam bolhas de ar, que eventualmente causavam interrup\u00e7\u00e3o da corrente el\u00e9trica durante a eletroforese. Outro aspecto relacionava-se com o uso de altas voltagens. Nestas condi\u00e7\u00f5es, o fluxo eletroosm\u00f3tico era suficientemente forte para arrastar o gel para fora do capilar. Por este motivo, o uso de agarose na fabrica\u00e7\u00e3o de capilares foi logo descartado, porque al\u00e9m do baixo ponto de fus\u00e3o, agarose cont\u00e9m grupos ioniz\u00e1veis, capazes de gerar fluxo eletroosm\u00f3tico.<\/p>\n\n\n\n

Em 1987, B. L. Karger e A. S. Cohen apresentaram solu\u00e7\u00f5es para ambos os problemas, descrevendo, a fabrica\u00e7\u00e3o detalhada de capilares preenchidos com g\u00e9is fisicos.<\/p>\n\n\n\n

O m\u00e9todo de Karger e Cohen consiste num pr\u00e9-tratamento do capilar com o reagente de dupla finalidade:<\/strong>\u00a0eliminar o fluxo eletroosm\u00f3tico atrav\u00e9s de uma liga\u00e7\u00e3o covalente com os grupos da superf\u00edcie capilar e evitar a extrus\u00e3o do gel durante opera\u00e7\u00e3o do sistema, atrav\u00e9s da liga\u00e7\u00e3o covalente com o gel a ser formado na etapa seguinte. O capilar \u00e9 ent\u00e3o preenchido com uma solu\u00e7\u00e3o tamponada e com catalisador.<\/p>\n\n\n\n

As extremidades do capilar s\u00e3o imersas em solu\u00e7\u00e3o tamp\u00e3o e a polimeriza\u00e7\u00e3o do gel ocorre, ap\u00f3s algumas horas.<\/p>\n\n\n\n

Uma das principais vantagens de realizar separa\u00e7\u00f5es eletrofor\u00e9ticas em um capilar \u00e9 que o seu formato possibilita a dissipa\u00e7\u00e3o eficiente do calor gerado pelo efeito Joule. Em CGE, esta vantagem \u00e9 duplamente verificada, em raz\u00e3o da geometria do capilar e das propriedades anti-convectivas do gel.<\/p>\n\n\n\n

2.2.1 ELETROFORESE DE \u00c1CIDOS NUCL\u00c9ICOS<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Por meio dessa t\u00e9cnica \u00e9 poss\u00edvel separar mol\u00e9culas em fun\u00e7\u00e3o da sua massa (tamanho), forma e compacta\u00e7\u00e3o. Trata-se de uma t\u00e9cnica r\u00e1pida, sens\u00edvel e precisa. A mol\u00e9cula em quest\u00e3o, por exemplo o DNA, migra em suportes (g\u00e9is de agarose ou acrilamida) por a\u00e7\u00e3o de uma corrente el\u00e9trica, com diferentes velocidades, dependendo do seu tamanho e forma. Quando submetido a um campo el\u00e9trico, as mol\u00e9culas de DNA migram para o p\u00f3lo positivo, pois s\u00e3o carregadas negativamente, e como for\u00e7a oposta \u00e0 migra\u00e7\u00e3o existe o atrito com o suporte (gel). Quanto maior a mol\u00e9cula, maior o atrito e mais lenta a migra\u00e7\u00e3o; portanto, mol\u00e9culas de tamanhos diferentes ter\u00e3o migrado uma dist\u00e2ncia diferente depois de algum tempo.<\/p>\n\n\n\n

A dist\u00e2ncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplica\u00e7\u00e3o \u00e9 comparada com a dist\u00e2ncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel.<\/p>\n\n\n\n

O DNA pode ser visualizado na presen\u00e7a de compostos intercalantes, sendo que o mais utilizado \u00e9 o brometo de et\u00eddio.<\/p>\n\n\n\n

Em presen\u00e7a desse composto, o DNA emite fluoresc\u00eancia por exposi\u00e7\u00e3o \u00e0 luz UV e, assim, mol\u00e9culas de um mesmo tamanho s\u00e3o visualizadas em um mesmo ponto do gel, formando uma faixa fluorescente.<\/p>\n\n\n\n

Se na amostra submetida \u00e0 corrente el\u00e9trica existir mais de um tamanho de mol\u00e9cula, estas ser\u00e3o separadas na migra\u00e7\u00e3o e, ent\u00e3o, ser\u00e3o vis\u00edveis bandas em diferentes localiza\u00e7\u00f5es do gel.<\/p>\n\n\n\n

Basicamente, duas matrizes s\u00f3lidas s\u00e3o utilizadas atualmente para eletroforese:<\/strong>\u00a0g\u00e9is de agarose e g\u00e9is de acrilamida.<\/p>\n\n\n\n

A escolha do tipo de gel depende do tamanho do fragmento e da diferen\u00e7a de tamanho de diferentes fragmentos de DNA que se quer visualizar. As duas subst\u00e2ncias formam tramas de poros de tamanhos vari\u00e1veis, possibilitando a separa\u00e7\u00e3o dos fragmentos, que ter\u00e1 sua efici\u00eancia dependente da concentra\u00e7\u00e3o do pol\u00edmero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicadas.<\/p>\n\n\n\n

Em qualquer um dos casos, estas subst\u00e2ncias s\u00e3o dissolvidas numa solu\u00e7\u00e3o-tamp\u00e3o eletrol\u00edtica, obrigatoriamente a mesma que recobrir\u00e1 o gel na cuba de eletroforese e possibilitar\u00e1 a passagem de corrente el\u00e9trica (Tamp\u00e3o de Corrida). Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris- Acetato EDTA). Quanto \u00e0 aplica\u00e7\u00e3o das amostras no gel, \u00e9 importante ressaltar que antes disso, elas s\u00e3o misturadas a outra solu\u00e7\u00e3o (Tamp\u00e3o de amostra), que tem como fun\u00e7\u00e3o aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tamp\u00e3o de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema. Al\u00e9m disso, o tamp\u00e3o de amostra possui um corante que possibilita a visualiza\u00e7\u00e3o do andamento da corrida.<\/p>\n\n\n\n

Apesar de sua versatilidade e relativo baixo n\u00edvel de dificuldade de realiza\u00e7\u00e3o, a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho e n\u00e3o quanto \u00e0 seq\u00fc\u00eancia.<\/p>\n\n\n\n

CONCLUS\u00c3O<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Ao t\u00e9rmino deste trabalho de pesquisa conclu\u00edmos que a eletroforese \u00e9 um processo anal\u00edtico de separa\u00e7\u00e3o de misturas, cujo principal agente \u00e9 o campo el\u00e9trico.<\/p>\n\n\n\n

Essa t\u00e9cnica passou por evolu\u00e7\u00f5es, com a introdu\u00e7\u00e3o de um suporte como papel de filtro, s\u00edlica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros.<\/p>\n\n\n\n

Atualmente o campo de aplica\u00e7\u00e3o da eletroforese tem sido amplamente difundido, devido \u00e1 simplifica\u00e7\u00e3o de aparelhagem utilizada e tamb\u00e9m \u00e1 disponibilidade de meios de suporte altamente purificados, o que veio diminuir em muito o tempo gasto na separa\u00e7\u00e3o.<\/p>\n\n\n\n

As principais t\u00e9cnicas de eletroforese s\u00e3o:<\/strong>\u00a0eletroforese em gel, eletroforese capilar e capilar em gel. A t\u00e9cnica de eletroforese capilar possui uma s\u00e9rie de vantagens, tais como a rapidez, versatilidade, um baixo custo por an\u00e1lise, alto poder se separa\u00e7\u00e3o (resolu\u00e7\u00e3o) e um consumo m\u00ednimo de amostras, reagentes e solventes. Al\u00e9m disso, oferece a possibilidade de automa\u00e7\u00e3o e detec\u00e7\u00e3o on-line.<\/p>\n\n\n\n

Entretanto esta t\u00e9cnica oferece algumas limita\u00e7\u00f5es, pois n\u00e3o \u00e9 adequada para a determina\u00e7\u00e3o de compostos vol\u00e1teis, n\u00e3o-polares e de massa molar baixa, os quais s\u00e3o melhores determinados por cromatografia gasosa.<\/p>\n\n\n\n

Tamb\u00e9m n\u00e3o \u00e9 muito adequada para a an\u00e1lise de pol\u00edmeros n\u00e3o i\u00f4nicos de massa molar alta e n\u00e3o \u00e9 t\u00e3o sens\u00edvel quanto a cromatografia l\u00edquida de alta efici\u00eancia.<\/p>\n\n\n\n

A\u00a0eletroforese<\/strong>\u00a0\u00e9 de grande import\u00e2ncia para as ci\u00eancias, permitindo a separa\u00e7\u00e3o e identifica\u00e7\u00e3o de mol\u00e9culas de DNA por meio da diferen\u00e7a de velocidade de migra\u00e7\u00e3o, identifica\u00e7\u00e3o de pessoas em testes de paternidade pela compara\u00e7\u00e3o de DNA, na ind\u00fastria farmac\u00eautica e at\u00e9 mesmo na agropecu\u00e1ria.<\/p>\n\n\n\n

Quais s\u00e3o os usos da eletroforese de DNA?<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Eletroforese de DNA\u00a0<\/strong>\u00e9 o processo de isolamento do fragmento de DNA baseado na atra\u00e7\u00e3o desse fragmento por um p\u00f3lo el\u00e9trico.<\/p>\n\n\n\n

Este processo \u00e9 usado para separar fragmentos de DNA com base em seus respectivos tamanhos por meio de uma atra\u00e7\u00e3o polar em um gradiente el\u00e9trico.<\/p>\n\n\n\n

Os \u00e1cidos nucl\u00e9icos formam os degraus de uma dupla h\u00e9lice de DNA, cuja estrutura \u00e9 composta de a\u00e7\u00facares desoxirribose e fosfatos, o que lhe confere uma carga negativa.<\/p>\n\n\n\n

Os cientistas podem tirar vantagem do fato de que essa carga negativa \u00e9 atra\u00edda por um eletrodo positivo por meio de um campo el\u00e9trico.<\/p>\n\n\n\n

O processo de eletroforese de DNA \u00e9 realizado executando o DNA em um substrato de gel atrav\u00e9s de um tamp\u00e3o eletrol\u00edtico ou substrato como \u00e1gua salgada.<\/p>\n\n\n\n

Um gel de agarose que foi embebido em \u00e1gua salgada pode resistir a um gradiente el\u00e9trico que passa por ele continuamente. Ao fazer muitas c\u00f3pias do DNA, geralmente por meio de um processo denominado rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase (PCR), um determinado gene pode ser copiado exponencialmente de uma \u00fanica ocorr\u00eancia.<\/p>\n\n\n\n

Os genes se manifestam fisicamente em segmentos de DNA.<\/p>\n\n\n\n

A agarose \u00e9 um substrato poroso que permite a passagem de pequenas mol\u00e9culas. O DNA \u00e9 atra\u00eddo por uma carga positiva, ent\u00e3o segmentos de DNA de tamanhos variados migram atrav\u00e9s de um gel de agarose eletrol\u00edtico dentro de um campo el\u00e9trico de \u00e1gua salgada.<\/p>\n\n\n\n

Segmentos grandes migram atrav\u00e9s do substrato de gel mais lentamente do que peda\u00e7os pequenos, ent\u00e3o os fragmentos de DNA s\u00e3o separados por tamanho.<\/p>\n\n\n\n

Ao executar um grande n\u00famero de fragmentos de DNA do mesmo tamanho em um gel de agarose, a amostra forma uma faixa espessa.<\/p>\n\n\n\n

A eletroforese de DNA requer o uso de um substrato eletrol\u00edtico, um campo el\u00e9trico e brometo de et\u00eddio, que \u00e9 um produto qu\u00edmico muito perigoso.<\/p>\n\n\n\n

O brometo de et\u00eddio intercala-se entre os \u00e1cidos nucl\u00e9icos em uma dupla h\u00e9lice de DNA e brilha sob uma luz ultravioleta (UV). Para visualizar uma banda de DNA em um gel de agarose, o gel pode ser embebido em brometo de et\u00eddio e fotografado sob luz ultravioleta. As bandas formadas por diferentes tamanhos de fragmentos de DNA ser\u00e3o mostradas, e um experimentador poder\u00e1 dizer se o gene de interesse – ou fragmento de DNA – est\u00e1 presente.<\/p>\n\n\n\n

Desde os menores organismos, como bact\u00e9rias, at\u00e9 os maiores organismos, como as baleias, as esp\u00e9cies se replicam copiando o DNA.<\/p>\n\n\n\n

O c\u00f3digo para a cria\u00e7\u00e3o das prote\u00ednas necess\u00e1rias \u00e0 vida est\u00e1 escrito nas instru\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas fornecidas pelas fitas de DNA. A an\u00e1lise de DNA \u00e9 usada em muitos estudos cient\u00edficos, incluindo investiga\u00e7\u00e3o criminal, estudos gen\u00e9ticos em modelos animais, recombina\u00e7\u00e3o bacteriana e classifica\u00e7\u00e3o de pept\u00eddeos. O DNA indica o c\u00f3digo para a transcri\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas, ent\u00e3o a eletroforese de DNA \u00e9 \u00fatil em qualquer situa\u00e7\u00e3o em que um cientista ou experimentador tenha motivos para replicar, separar ou examinar genes em fitas de DNA.<\/p>\n\n\n\n

Fonte:<\/strong>\u00a0people.ufpr.br\/Aline Marin\/B\u00e1rbara Gomes\/Bruna Girardi\/Ethiane Mezadri\/www.genome.gov<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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